T4 Polynucleotide Kinase

产品编号：M0201L 品牌：New England Biolabs 原厂货号：M0201L
产品分类：克隆 > DNA/RNA修饰酶 > 激酶
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描述：

特性：

■ DNA 或 RNA 5' 末端的磷酸化，以便进行连接反应。

■ DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序

■ 用 T4 多聚核苷酸激酶 (NEB #M0201) 除去 3' 磷酸基团

■ 将 3' 端已经磷酸化的单核苷酸 5' 磷酸化，制备 pNp 底物，利用 T4 多聚核苷酸激酶 (缺失 3' 磷酸酶

活性) (NEB#M0236) 将其加到 DNA 或 RNA的 3' 端

■ 用 T4 多聚核苷酸激酶 (缺失 3' 磷酸酶活性) (NEB #M0236) 对 3' 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5' 端

进行标记

概述：T4 多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在 ATP 的 γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链 DNA 或 RNA) 的 5′-羟基末端以及 3′-单磷酸核苷间进行转移和交换(1-5)。T4 多聚核苷酸激酶 (NEB #M0201) 还具有 3′磷酸酶活性，将 3′-磷酸基团从寡核苷酸的 3′磷酸末端、脱氧 3′-单磷酸核苷和脱氧 3′-二磷酸核苷上水解掉(1)。经修饰后的酶 (NEB #M0236) 具有所有激酶的活性，但是缺失了 3′磷酸酶活性 (6,7)。

来源：重组E. coli菌株，克隆有T4多聚核苷酸激酶或修饰的T4多聚核苷酸激酶基因。

反应条件;1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液 [70 mM Tris-HCl (pH7.6) , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT]。37°C 温育。

单位定义：1 单位即 1 个 Richardson 单位，指 37℃条件下，30 分钟内催化 1 nmol 酸不溶性 [32P] 掺入所需要的酶量 (1) 。

浓度：10,000 units/ml。

热失活：65°C 20分钟。

注意事项：

最适酶活力的发挥需要新鲜缓冲液 (在旧缓冲液中，由于氧化造成的 DTT 含量的减少会降低酶活力) 。
放射性标记反应：50 μl 反应体系中，用 1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50 pmol 的 γ-[³²P]ATP 和 20 单位的酶 37℃ 温育 30 分钟可催化 1-50 pmol 的 5' 末端磷酸化。[33P] ATP 可代替 [32P] ATP 作标记反应。
CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可替代 ATP 作为磷酸供体。
要提高平齐末端或 5' 凹陷末端的磷酸化效率，可在加入 T4 多聚核苷酸激酶前，先将 DNA 溶液于 70℃ 加热 5 分钟，然后冰上冷却，或者加入5% (W/V) 的 PEG-8,000。
T4 多聚核苷酸激酶需要 ATP 才能发挥活性，但是为了适用于高活力的放射性标记反应，在随酶提供的反应缓冲液中不含 ATP。

一般来说，进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下，T4 多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中 37℃ 温育 30 分钟即可。反应后的产物可直接进行连接，无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它 DNA 片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前热失活 T4 多聚核苷酸激酶。