pFC17K HaloTag? CMVd3 Flexi? Vector

. Flexi^® System, Entry/Transfer(Cat.# C8640)

• Carboxy Flexi^® Enzyme Blend (SgfI and EcoICRI) (Cat.# R1901)

• N 末端Flexi^® 载体( 如pFN21A、pFN21K)

注意： 融合到C 末端标签的蛋白编码序列就不能再在其它表达载体中转移了。如需使蛋白编码序列在多个载体之间转移，在将该序列转移到C 末端Flexi^® 载体上之前，应先把该序列克隆到不带标签的Flexi^® 载体上，或克隆到带N 末端标签的载体上。

1. 使用Flexi^® 载体引物设计工具(Flexi^® Vector Primer DesignTool)，为目的蛋白编码区设计引物。

2. 使用高保真DNA 聚合酶进行扩增，并纯化扩增产物。

3. 使用SgfI 和PmeI 消化扩增产物，纯化消化产物。

4. 使用SgfI 和PmeI 消化受体Flexi^® 载体(N 端Flexi 载体)。

5. 加热，使限制酶失活；连接PCR 产物和受体Flexi^® 载体。

6. 转化，铺板( 含有氨苄青霉素或卡那霉素的LB 板)。

7. 筛选克隆；测序验证插入片段。

使用N 端HaloTag^® Flexi^® 载体制备HaloTag^® 融合蛋白的方案概要( 详细方案，请参见Flexi^® 载体系统技术手册TM254)

Flexi^® System, Entry/Transfer(Cat.# C8640)依照上面的“入门反应方案”。