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实验名称:利用酵母双杂交系统研究蛋白质的相互作用

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描述:

        酵母双杂交系统是以酵母作为真核蛋白相互作用的模型,其原理与对真核细胞转录调控起始过程的认识密切相关。研究发现,许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。分别为DNA结合域以及转录激活域。单独的DNA结合域不能激活基因转录,单独的转录激活域也不能激活上游激活序列的下游基因,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的 功能。

        根据酵母双杂交系统的原理,如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性,即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白质X、Y的编码序列插入AD和BD的载体的多克隆位点中,然后共同转入含有报告基因的酵母菌株,如果蛋白质X与Y能相互作用,则启动报告基因的转录和表达,通过检测报告基因的表达情况,就可以间接反映蛋白质X和Y是否具有相互作用以及作用的强弱。如果将蛋白质Y换为取自组织或血液的cDNA文库,则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白质,并且可以获得编码这些蛋白质的cDNA。

        酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白质之间的相互作用及分离新的与已知蛋白质作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用具有以下优点:1.作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤;2.检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况;3.检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用;4.酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白质。

 



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